生物检材中苯丙胺类兴奋剂、度冷丁和氯胺酮的测定 SFZ JD0107004-2010（20100407）
1、全国人民代表大会常务委员会关于司法鉴定管理问题的决定(20051001)
6、GAT1193－2014人身损害误工期、护理期、营养期评定规范（20141126）
中华人民共和国司法部司法鉴定管理局于2010年4月7日公告公布，自2010年4月7日起施行。
目 录
1范 围
2规范性引用文件
第一篇 免疫筛选法
3原 理
4试 剂
5操作方法
6结果判定
第二篇 气相色谱一质谱联用法
7原 理
8试剂和材料
9仪 器
10测定步骤
11结果计算
12方法检出限
第三篇 液相色谱一串联质谱法
13原 理
14试剂和材料
15仪 器
16测定步骤
17结果计算
18方法检出限
附录A（资料性附录） 血液、尿液和毛发中AMP、 MAMP、 MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮的检出限
1范 围
本标准规定了血液、尿液及毛发中苯丙胺（AMP）、甲基苯丙胺（MAMP）、3、4亚甲双氧甲基苯丙胺（MDMA）、4、5-亚甲双氧苯丙胺）（MDA）,度冷丁和氯胺酮的测定方法。
本标准适用于血液、尿液及毛发中AMP、 MAMP、 MDMA、MDA、度冷丁和氯胺酮的定性定量分析。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008, IS03696：1987,MOD）
GA/T 122毒物分析名词术语
第一篇 免疫筛选法
3原 理
采用高度特异性的抗原一抗体反应的免疫胶体金层析技术，通过单克隆抗体竞争结合苯丙胺或甲基苯丙胺偶联物和尿液中可能含有的苯丙胺或甲基苯丙胺，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的苯丙胺或甲基苯丙胺偶联物和被胶体金标记的抗苯丙胺或甲基苯丙胺单克隆抗体。
4试 剂
苯丙胺尿液胶体金法试剂盒，甲基苯丙胺尿液胶体金法试剂盒。
5操作方法
用吸管吸取尿液检材，滴入试剂盒的样品孔中5滴（约150～200uL）,3～5分钟后观察结果。
6结果判定
6.1苯丙胺尿液胶体金法试剂盒
6.1.1阳性
仅质控区C出现紫红色带，而测试区T无紫红色带，提示含有苯丙胺成分。
6.1.2阴性
质控区C及测试区T均出现紫红色带，表明尿液中无苯丙胺或苯丙胺浓度在1000ng/mL以下。
6.1.3无效
质控区C未出现紫红色带，结果无效，应重新检验。
6.2甲基苯丙胺尿液胶体金法试剂盒
6.2.1阳性
仅质控区C出现紫红色带，而测试区T无紫红色带，表明甲基苯丙胺浓度在1OOOng/mL以上。
6.2.2阴性
质控区C及测试区T均出现紫红色带，表明尿液中无甲基苯丙胺或甲基苯丙胺浓度在1OOOng/mL以下。
6.2.3无效
质控区C未出现紫红色带，结果无效，应重新检验。
第二篇 气相色谱一质谱联用法
7原 理
利用苯丙胺类兴奋剂、度冷丁和氯胺酮易溶于有机溶剂、难溶于水的特点，在碱性条件下用有机溶剂从生物检材中提出，用气相色谱一质谱联用仪进行检测，经与平行操作的苯丙胺类兴奋剂或度冷丁、氯胺酮对照品比较，以保留时间和特征碎片离子定性分析。
8试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
8.1AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁和氯胺酮
纯度≥98%。
8.2AMP、 MAMP, MDMA, MDA、度冷丁、氯胺酮对照品溶液的制备
分别精密称取对照品AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁、氯胺酮各适量，用甲醇配成1mg/mL的对照品储备溶液，置于冰箱中冷冻保存，有效期为12个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备液稀释而得，冰箱中冷藏保存，有效期为6个月。
8.310%氢氧化钠溶液。
8.4乙醚。
8.5甲醇。
8.6丙酮。
8.7 0.1%十二烷基磺酸钠溶液。
8.8 0.1%洗洁精溶液。
8.9 O.lmol/L盐酸溶液。
9仪 器
9.1气相色谱一质谱联用仪
配有电了轰击源（EI）。
9.2分析天平
感量0.1mg。
9.3微波炉。
9.4涡旋混合器。
9.5离心机。
9.6恒温水浴锅。
9.7空气泵。
9.8移液器。
9.9具塞离心试管。
9.10冷冻研磨机。
10测定步骤
10.1样品预处理
10.1.1尿液直接提取
取尿液2mL置于1OmL具塞离心管中，用10%氢氧化钠溶液调至pH>11，用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约600C水浴中挥干，残留物用30uL甲醇溶解，取1uL进气相色谱/质谱联用仪分析。
10.1.2血液直接提取
取血液2mL置于1OmL具塞离心管中，加入10%氢氧化钠溶液0.2mL，用乙醚3mL提取，以下同10.1.1项下操作。
10.1.3毛发提取
10.1.3.1毛发采集
贴发根处剪取毛发，发根处作标记。量取长度。
10.1.3.2毛发洗涤
毛发样品依次用0.1%十二烷基磺酸钠溶液、0.1%洗洁精溶液、水和丙酮振荡洗涤一次，晾干后剪成约1mm段，供检。
10.1.3.3毛发的水解
10.1.3.3.1毛发的酸水解
称取50mg毛发，加1mLO.lmol/L盐酸溶液浸润，450C水浴水解12～15小时，取出后用10%氢氧化钠溶液调至pH>ll。
10.1.3.3.2毛发的碱水解
称取50mg毛发，加1mL 10%氢氧化钠溶液，800C水浴水解5～1Omin，取出。
10.1.3.4毛发的提取
毛发水解液用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心分层，转移乙醚层至另一离心管中，约600C水浴中挥干。残留物用30uL甲醇溶解，取1uL进气相色谱-质谱联用仪分析。
10.2样品测定
10.2.1气相色谱一质谱参考条件
a）色谱柱：HP-SMS毛细管柱（30mx0.25mmx0.25}m）或相当者；
b）柱温：1000C保持1.5min，以250C/min程序升温至2800C，保持15min；
c）载气：氦气，纯度）99.999%，流速：1.OmL/min ；
d）进样口温度：2500C；
e）进样量：1uL；
幻电了轰击源：70eV；
g）四极杆温度：1500C；
h）离子源温度：2300C；
i）接口温度：2800C；
J）检测方式：full scan；
k）质量范围50-5OOamu。
l） AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮的保留时间与特征碎片离子见表1。
表1 AMP、 MAMP、MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮的色谱峰保留时间与碎片离子
10.2.2定性测定
进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差小于2%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子相对丰度比与添加对照品的离子相对丰度比之相对误差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在这种化合物。
表2相对离子丰度比的最大允许相对误差（%）
10.2.3定量测定
采用外标—校准曲线法或单点法定量。用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系列校准样品，以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线，并且保证所测样品中目标物的响应值在其线性范围内。当空白检材中添加目标物浓度在检材中目标物浓度的士50%以内时，可采用单点校准。
10.3平行试验
样品应按以上步骤同时平行测定两份。
平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算，双样相对相差不得超过20（腐败检材
不超过30%）。双样相对相差按式（1）计算：
式中：
C1、 C2——两份样品平行定量测定的结果；
——两份样品平行定量测定结果的平均值（C1+C2）/2。
10.4空白试验
除以相同基质空白替代检材外，均按上述步骤进行。
11结果计算
以外标一校准曲线法或按式（2）计算被测样品中AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮
浓度：
式中：
C——检材中目标物的浓度}wgimL或wgig}；
A1——检材中目标物的峰面积；
A2——空白检材中添加目标物的峰面积；
W——空白检材中目标物的添加量（wg>；
W1——检材量（mL或g）。
12方法检出限
血液、尿液和毛发中苯丙胺类兴奋剂、度冷丁和氯胺酮的检出限见附录A。
第三篇 液相色谱一串联质谱法
13原 理
利用苯丙胺类兴奋剂、度冷丁和氯胺酮易溶于有机溶剂、难溶于水的特点，在碱性条件下用有机溶剂从生物检材中提出，提取后的样品用液相色谱一串联质谱法（LC-MS/MS）的多反应监测（MRM）模式进行检测，经与平行操作的苯丙胺类兴奋剂或度冷丁、氯胺酮对照品比较，以保留时间和两对母离子/子离子对进行定性分析。
14试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
14.1AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮对照品及溶液的制备
同8.1及8.2。
14.2丙酮。
14.3乙醚。
14.4 10%氢氧化钠溶液。
14.5 O.lmol/L盐酸溶液。
14.6 0.1%十二烷基磺酸钠溶液。
14.7 0.1%洗洁精溶液。
14.8乙睛
色谱纯。
14.9甲酉麦
优级纯。
14.10乙酸胺
色谱纯。
14.11流动相缓冲液
20mmo1/L乙酸铰和0.1%甲酸缓冲液：分别称取1.54g乙酸铰和1.84g甲酸置于1 OOOmL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值约为4。
15仪 器
15.1液相色谱一串联质谱仪
配有电喷雾离子源（ESI）。
15.2分析天平
感量0.lmg。
15.3涡旋混合器。
15.4离心机。
15.5恒温水浴锅。
15.6移液器。
15.7具塞离心试管。
15.8冷冻研磨机
16测定步骤
16.1样品预处理
16.1.1尿液提取
取尿液2mL置于1 OmL具塞离心管中，用10%氢氧化钠溶液调至pH>11，用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约600C水浴中挥干，残留物中加入100}L乙睛：流动相缓冲液（70： 30）进行溶解，取5}L进LC-MS/MS分析。
16.1.2血液提取
取血液2mL置于1 OmL具塞离心管中，加入10%氢氧化钠溶液0.2mL，用乙醚3mL提取，以下同16.1.1项下操作。
16.1.3毛发提取
称取50mg毛发，同10.1.3.3项酸水解或碱水解后，用乙醚3mL提取，以下同16.1.1项下操作。
16.2样品测定
16.2.1液相色谱一串联质谱参考条件
a）色谱柱：Allure PFP Propyl 100mmx2.1mmx5}m或相当者，前接保护柱；
b）柱温：室温；
c）流动相：V（乙睛）：V（缓冲液）一（70：30）；
d）流速：200uL/min；
e）进样量：SQL；
幻扫描方式：正离子扫描（（ESI+） ；
g）检测方式：多反应监测}MRM）；
h）离子喷雾电压：5500 V；
i）离子源温度：5000C；
J）每个化合物分别选择2对母离子/子离子对作为定性离子对。其定性离子对、定量离子对、去簇电压（（DP） ,碰撞能量（（CE）和保留时间C tR）见表30
表3AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮的定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）和保留时间（tR）
16.2.2定性测定
进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差小于2%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现所选择的离了对，而且所选择的离了对相对丰度比与添加对照品的离了对相对丰度比之相对误差不超过表4规定的范围，则可判断样品中存在这种化合物。
表4相对离了对丰度比的最大允许相对误差（%）
16.2.3定量测定
采用外标一校准曲线法或单点法定量。用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系列校准样品，以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线，并且保证所测样品中目标物的响应值在其线性范围内。当空白检材中添加目标物浓度在检材中目标物浓度的士50%以内时，可采用单点校准。
16. 3平行试验
样品应按以上步骤同时平行测定两份。
平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算，双样相对相差不得超过20（腐败检材不超过30%）。双样相对相差按式（1）计算：
式中：
C1、 C2——两份样品平行定量测定的结果；
——两份样品平行定量测定结果的平均值（C1+C2）/2。
16.4空白试验
除以相同基质空白替代检材外，均按上述步骤进行。
17结果计算
以外标一校准曲线法或按式（2）计算被测样品中AMP、MAMP、MDMA、MDA、度冷丁及氯胺酮浓度：
式中：
C——检材中目标物的浓度（ug/mL或ug/g）；
A1——检材中目标物的峰面积；
A2——空白检材中添加目标物的峰面积；
W——空白检材中目标物的添加量（ug）；
W1——检材量（mL或g）。
18方法检出限
血液、尿液和毛发中苯丙胺类兴奋剂、度冷丁和氯胺酮的检出限见附录A。
·附录A
（资料性附录）血液、尿液和毛发中AMP、 MAMP、 MDMA、MDA、
度冷丁及氯胺酮的检出限
血液、尿液和毛发中AMP, MAMP, MDMA, MDA,度冷丁及氯胺酮的检出限见表A。
表A 生物检材中AMP, MAMP, MDMA, MDA,度冷丁及氯胺酮的检出限
戴卫祥 律师
戴卫祥，辽宁东亚律师事务所律师、合伙人，专注于司法鉴定业务。2001年开始从事法律工作，具有丰富的法律理论和实践经验，尤其对刑事鉴定、伤残鉴定、机动车交通事故鉴定、痕迹物证鉴定、建设工程鉴定、消防鉴定等具有丰富的办案经验，积累了大量的成功案例。
戴卫祥律师联系方式
电话：13940919059
微信号码：dailvshi8
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司法鉴定律师
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